Caracterização funcional de proteínas hipotéticas de Leptospira interrogans como adesinas e potenciais antígenos vacinais e para diagnóstico / Functional characterization of hypothetical proteins in Leptospira interrogans as adhesins and potential vaccine and diagnostic antigens

Leptospira spp. constitui um grupo de bactérias espiroquetas gram-negativas englobando espécies saprofíticas, intermediárias e patogênicas, sendo as últimas agentes causadores da leptospirose, doença zoonótica de alcance mundial e endêmica em regiões tropicais em desenvolvimento. O crescente número de espécies identificadas de leptospiras destaca ainda mais sua diversidade genética e mecanismos de virulência únicos, muitos deles com função ainda desconhecida. Esforços para o desenvolvimento de novas vacinas com proteção cruzada e efeito duradouro revelaram possíveis candidatos vacinais que necessitam ser adequadamente validados, sendo assim, há ainda uma urgente necessidade de uma vacina universal contra a leptospirose capaz de controlar e reduzir os surtos cada vez mais frequentes da doença. Adesinas são importantes fatores de virulência em diversos patógenos, constituindo antígenos promissores para o desenvolvimento de vacinas contra a leptospirose, assim como para o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais rápidos e precisos. Previamente, foram identificadas três proteínas hipotéticas conservadas em L. interrogans pela técnica de phage display, denominadas arbitrariamente como LepA069, LepA962 e LepA388. A expressão do gene codificador da proteína LepA069 apresentou aumento de aproximadamente 70 % em animais infectados por leptospiras virulentas, representando a primeira evidência funcional desta proteína ainda desconhecida. Porções recombinantes da lipoproteína hipotética LepA962 (LepA962_Nt e LepA962_Phg) foram obtidos, sendo demonstrada a forte interação da proteína LepA962_Phg, contendo a sequência identificada por phage display, com laminina, fibronectina plasmática, colágeno I e fibrinogênio de maneira dose-dependente. Adicionalmente, LepA962_Phg apresentou ligação às células VERO e à sua matriz extracelular secretada, e o soro obtido a partir desta proteína recombinante foi capaz de se ligar à superfície de leptospiras virulentas, indicando que LepA962_Phg pode representar um importante domínio de interação entre as leptospiras e seu hospedeiro. Finalmente, a proteína LepA388 pertencente a uma extensa família de proteínas modificadoras de virulência com função desconhecida (DUF_61), presente apenas nas leptospiras patogênicas mais virulentas, apresentou aumento na expressão de seu gene codificador em animais infectados por leptospiras virulentas de acordo com dados na literatura. Além disso, porções recombinantes da região Nterminal desta proteína apresentaram ligação a laminina, colágenos I e IV, vitronectina e fibronectinas plasmática e celular, principalmente considerando a sequência identificada por phage display. Estes dados reforçam as predições de modelos tridimensionais da proteína LepA388 e de outros membros da família DUF_61, as quais identificam domínios semelhantes a toxinas (como abrina e CARDS) responsáveis pela ligação e internalização celulares nos hospedeiros. Dados recentes sugerem um possível papel citotóxico desempenhado pelas proteínas desta família em leptospiras, as quais podem também ser consideradas potenciais candidatas vacinais e para diagnóstico da leptospirose, devido à sua distribuição restrita em espécies e cepas patogênicas de importância para saúde humana.

Leptospira spp. constitutes a group of gram-negative spirochete bacteria comprising saprophytic, intermediate and pathogenic species, the last being causative agents of leptospirosis, a zoonotic disease of worldwide extent and endemic in developing tropical regions. The growing number of identified leptospiral species further highlights their genetic diversity and unique virulence mechanisms, many of them with unknown function. Efforts to develop new vaccines with cross-protection and long-lasting effect have revealed possible vaccine candidates that need to be properly validated. Therefore, there is still an urgent need for a universal vaccine against leptospirosis capable of controlling and reducing the increasing outbreaks of the disease. Adhesins are important virulence factors in several pathogens, constituting promising antigens for the development of vaccines against leptospirosis, as well as for the development of faster and more accurate diagnostic methods. Previously, three conserved hypothetical proteins in L. interrogans were identified by phage display technique, arbitrarily named as LepA069, LepA962 and LepA388. Expression of the LepA069 encoding gene showed an increase of approximately 70 % in animals infected by virulent leptospires, representing the first functional evidence of this still unknown protein. Recombinant portions of the hypothetical lipoprotein LepA962 (LepA962_Nt and LepA962_Phg) were obtained, demonstrating the strong interaction of the LepA962_Phg protein, containing the sequence identified by phage display, with laminin, plasma fibronectin, collagen I and fibrinogen in a dose-dependent manner. Furthermore, LepA962_Phg showed binding to VERO cells and its secreted extracellular matrix, and the serum obtained from this recombinant protein was able to bind to the surface of virulent leptospires, indicating that LepA962_Phg may represent an important domain of interaction between leptospires and its host. Finally, LepA388 protein belonging to an extensive family of virulence modifying proteins with unknown function (DUF_61), present only in the most virulent pathogenic leptospires, showed an increase in the expression of its encoding gene in animals infected by virulent leptospires according to data in literature. Moreover, recombinant portions of the N-terminal region of this protein showed binding to laminin, collagens I and IV, vitronectin and plasma and cell fibronectins, especially considering the sequence identified by phage display. These data support the predictions of three-dimensional models of the LepA388 protein and other members of the DUF_61 family, which identify toxin-like domains (such as abrin and CARDS) responsible for cellular binding and internalization in hosts. Recent data suggest a possible cytotoxic role played by proteins of this family in leptospires, which can also be considered potential vaccine candidates and antigens for diagnosis, due to their restricted distribution in pathogenic species and strains of importance to human health

Caracterização bioquímica e funcional da proteína XadA3 de Xylella fastidiosa / Biochemistry and functional characterization of Xylella fastidiosa XadA3 adhesin

Gram-negativas e é utilizado por diversos patógenos para colonizar seus hospedeiros, sendo o primeiro passo do processo de desenvolvimento do biolfilme. Uma variedade de apêndices celulares e proteínas está envolvida na adesão bacteriana, tais como pili, fimbrias, adesinas fimbriais e afimbriais. O fitopatógeno Xylella fastidiosa, agente causal de importantes doenças como a doença de Pierce de videiras, a clorose variegada dos citros e a síndrome do rápido declínio de oliveiras, possui em sua superfície várias dessas estruturas que são potencialmente responsáveis pela colonização eficiente de insetos-vetores e plantas hospedeiras. Entre as adesinas afimbriais codificadas no genoma dessa bactéria, três XadA (XadA1, Hsf/XadA2 e XadA3) são classificadas como autotransportadores triméricos. Dados da literatura sugerem que XadA1 e XadA2 são importantes para a formação do biofilme, porém a função de XadA3 ainda não havia sido investigada. Nesse trabalho, tivemos como objetivo caracterizar bioquímica e funcionalmente a proteína XadA3 e obter informações adicionais sobre o papel desempenhado por XadA1 e XadA2 na adesão e virulência de X. fastidiosa. Utilizando imunodetecção com um anticorpo policlonal anti-XadA3 por nós obtido, demonstramos que essa proteína localiza-se na superfície bacteriana e medeia a adesão intercelular. A caracterização dos fenótipos de mutantes de deleção de cada um dos genes das adesinas XadA revelou que o mutante ΔxadA3 tem reduzida capacidade de agregação celular e formação de biofilme quando comparado tanto aos mutantes ΔxadA1 e ΔxadA2 como à cepa selvagem Temecula. A deleção dos genes xadA afeta marginalmente o perfil de expressão gênica global avaliado através de RNAseq das cepas mutantes comparativamente à cepa selvagem, porém destaca-se, nas cepas mutantes, o aumento nos níveis dos transcritos de lipases/esterases. Já foi descrito que essas enzimas parecem atuar na degradação do tecido vegetal associada aos sintomas da doença de Pierce de videiras. A deleção de xadA3 resulta em um fenótipo de hipervirulência em videiras, mas também de deficiência de transmissão pelo inseto-vetor. O conjunto dos resultados obtidos nesse trabalho evidenciam o importante papel desempenhado pelas adesinas XadAs, particularmente XadA3, na adesão intercelular, no desenvolvimento do biofilme e na virulência de X. fastidiosa

Adhesion is a widely conserved mechanism of virulence among Gram-negative bacteria that is used by several pathogens to colonize their hosts, being the first step in biolfilm development. A variety of appendages and proteins are involved in bacterial adhesion, such as pili, fimbriae, fimbrial and afimbrials adhesins. The phytopathogen Xylella fastidiosa, causal agent of important diseases such as Pierce's disease of grapevines, citrus variegated chlorosis and olive quick decline syndrome, harbours on its surface several of these structures that are potentially responsible for efficient colonization of insect vectors and plant hosts. Among the afimbrial adhesins encoded in the genome of this bacterium, three XadAs (XadA1, Hsf/XadA2 and XadA3) are classified as trimeric autotransporters. Data from the literature suggest that XadA1 and XadA2 are important for biofilm formation, but XadA3 function has not been yet investigated. In this work, we aimed to biochemically and functionally characterize the XadA3 protein and gather additional information about the role played by XadA1 and XadA2 in X. fastidiosa adhesion and virulence. Using immunodetection with a polyclonal anti-XadA3 antibody, we have demonstrated that this protein localizes to the bacterial surface and mediates intercellular adhesion. Phenotypic characterization of the deletion mutants of XadA adhesins encoded genes revealed that the ΔxadA3 mutant has reduced cell aggregation capacity and biofilm formation when compared to both ΔxadA1 and ΔxadA2 mutants as well as to Temecula wild type strain. Deletion of the xadA genes marginally affects the global gene expression profile assessed by RNA-seq of the mutant strains compared to the wild-type strain, eventhough an increase in lipase/esterase transcripts levels was observed in the mutant strains. It has been reported that these enzymes appear to participate in the degradation of plant tissue that is associated with symptoms of Pierce's disease of grapevines. The deletion of xadA3 results in a phenotype of hypervirulence in grapevines but also of deficiency in insect-vector transmission. The results obtained in this work evidenced the important role played by XadAs adhesins, particularly XadA3, in X. fastidiosa intercellular adhesion, biofilm development and virulence

Virulence genes in Escherichia coli isolated from feces and urine of cats / Genes de virulência em Escherichia coli isolados de fezes e de urina de gatos

Determinadas linhagens de Escherichia coli comportam-se como patógenos em gatos, causando doenças gastrointestinais e extraintestinais. Neste estudo, foram utilizadas 205 cepas de E. coli isoladas de amostras de fezes provenientes de 19 gatos diarreicos e de 21 gatos não diarreicos, e três amostras de urina provenientes de gatos com infecção do trato urinário (ITU). Essas cepas foram testadas pela técnica de reação em cadeia da polimerase com múltiplos iniciadores para a detecção da presença de genes codificadores de adesinas (pap, sfa e afa), assim como para a detecção dos genes produtores da toxina Shiga-like (stx1 e stx2) e do gene da intimina (eae). Oitenta e dois isolados possuíam genes codificadores de adesinas, dos quais 11 apresentaram o gene pap, 41 apresentaram o gene sfa e 27 apresentaram uma combinação dos genes pap + sfa. Nenhuma das cepas examinadas apresentou os genes stx1, stx2 ou afa. Três isolados provenientes de um gato diarreico apresentaram uma combinação dos genes sfa + eae. Animais de companhia (pets) são reservatórios naturais para diversos organismos, especialmente linhagens ExPEC, as quais são potencialmente capazes de infectar seres humanos, o que representa um motivo de grande preocupação.(AU)

Avaliação da atividade imunogênica de três proteínas de Leptospira interrogans expressas em Escherichia coli / Evaluation of immunogenic activity of three proteins of Leptospira interrogans expressed in Escherichia coli

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. No mundo, aproximadamente 500.000 casos são reportados a cada ano, com 10% de taxa de mortalidade. Atualmente, vacinas contra leptospirose são compostas por células inativadas e são ineficazes em diferentes aspectos. Após analise do genoma, os genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 foram escolhidos para caracterização da imunogenicidade de suas respectivas proteínas. Esses genes foram clonados no vetor de expressão pAE e as proteínas recombinantes foram purificadas. Os resultados sugerem que essas proteínas podem estar localizadas na membrana externa, são imunogênicas, possivelmente expressas durante a infecção e que podem ter envolvimento em mecanismos de evasão do sistema imune e de patogenicidade da bactéria. Além disso, em um de dois experimentos, a proteína rLIC11084 induziu imunidade protetora parcial em hamsters imunizados frente desafio letal.

Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. In the world, nearly 500,000 cases are reported each year, with 10% of mortality rate. Currently, vaccines against leptospirosis are composed by inactivated cells that are ineffective in many aspects. After genome analysis, the genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 were chosen for immunogenicity characterization of their respective proteins. These genes were cloned in the pAE expression vector and the proteins encoded by LIC11087, LIC11228 and LIC11084 were purified. The results suggest the localization of these proteins in the bacterial outer membrane, are immunogenic, are possibly expressed during infection and may have involvement in mechanisms of immune system evasion and pathogenicity. Moreover, in one of two experiments, the rLIC11084 protein induced partial protective immunity of immunized hamsters against lethal challenge.

Estudo da virulência, adesão e características fenotípicas de isolados do complexo Sporothrix / Study of virulence, adhesion and phenotypic characteristics of isolates of Sporothrix complex

A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fundo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 oC e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que esta táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com amior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a colocalização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies...

Sporotrichosis is a chronic and infectious diseases that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 oC and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identifies as S. schenckii showed considerable genetic variability, sugesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us o determine whether...